Não se preocupe com desempenho - dois discos são melhores apenas quando você trabalha com os dois ao mesmo tempo, como quando copia de um para o outro.
Ou se você tiver duas VMs ativas e funcionando ao mesmo tempo, ter cada uma em seu próprio disco melhoraria a taxa de transferência do disco, sob a condição de ter uma CPU multi-core (ou multi-thread). Mas se ambas as VMs ativas estiverem no mesmo disco rígido, então é totalmente sem importância em qual disco elas são.
Dito isto, aqui estão algumas matemáticas: 2 x 320 = 640 > 500. Então você ganha 140 GB.
Se você optar pela solução de 2 discos, para mim 320GB é muito grande para um disco do sistema. Eu iria ainda mais longe e particionaria o primeiro disco em, digamos, 40 GB de disco de sistema com o Windows e todos os aplicativos. Isso facilita o backup de uma imagem do disco do sistema, que eu faço sistematicamente apenas no caso antes de deixar o Windows Update da Microsoft destruir meu sistema em execução.
Nesse caso eu teria:
C = disco 1 partição 1 (40 GB)
D = disk2 (320 GB)
Partição E = disk1 2 (280 GB)
Por favor, note que reparticionar a unidade C provavelmente envolverá a reinstalação do Windows (ou a restauração da partição de restauração do OEM após a nova partição).