Parece que o (s) seu (s) pool (s) de aplicativos não está sendo iniciado (s). Abra o Gerenciador do IIS e clique em Pools de Aplicativos, verifique a coluna Status e certifique-se de que todos digam Started (ou pelo menos que o DefaultAppPool diz Started). Se não for iniciado, clique com o botão direito do mouse no pool de aplicativos e escolha Iniciar. Se você receber um erro, informe-nos.
Além disso, o que ele diz no log de eventos do seu aplicativo?
EDITAR:
Se um site / diretório virtual estiver configurado como um aplicativo, o pool de aplicativos associado deverá ser iniciado e funcional para que ele sirva a qualquer recurso, estático ou não. Caso contrário, você receberá um erro de resposta 503. A identidade dos pools de aplicativos está definida para sua conta? Parece que você tem corrupção de conta acontecendo. Tente criar uma nova conta (de administrador) e defina o pool de aplicativos para ser executado usando essa conta e veja se eles começam a funcionar.
Nota: Por favor, verifique o usuário que está operando IIS & O Pool de aplicativos deve ser o mesmo ou atribuir o usuário do serviço de rede ao pool de aplicativos.