Se você quiser preencher sua GUI com novos widgets enquanto seu aplicativo estiver em execução, é completamente errado criar um monte de arquivos .ui separados e GtkBuilders para eles. É muito fácil criar um único widget a partir do código.
Suponho que você use o Python, já que você marcou sua pergunta como pygtk .
Veja um exemplo simples:
from gi.repository import Gtk
e:
my_window = Gtk.Window()
my_button = Gtk.Button()
my_window.add(my_button)
my_window.show_all()
Bem, isso não funcionará sozinho, mas é assim que você pode criar novos widgets. Para detalhes sobre widgets específicos, acesse este elegante tutorial / docs: link