windows 8.1 , 64 bit version , and I have a 16 bit assembler program ...
Isso realmente diz tudo.
O Windows Vista através do Windows 8.1 x64 não pode executar aplicativos de 16 bits. O Windows no Windows pode emular um ambiente de 32 bits, mas voltar a programas de 16 ou 8 bits não é suportado.