Parece um erro de permissão. Você se lembrou de adicionar o Usuário do IIS IIS_IUSRS
à lista de usuários que podem acessar os arquivos?
Eu adicionei um site da ASP.NET MVC3 ao ISS (que estava funcionando bem no depurador). Ao visualizar o site em um navegador, tudo parecia estar funcionando bem, exceto que todos os arquivos CSS e JS estavam retornando um 404.
Aqui está o site no Gerenciador do IIS:
Outros detalhes: