Se eu ativar innodb_file_per_table (não ativo no momento), isso destruirá minhas tabelas existentes?
Não, mas você precisará fazer um dump sql e recarregar ou, alternativamente, otimizar a tabela antes que as tabelas existentes sejam movidas para seus próprios arquivos.
É claro que, como em qualquer alteração arquitetural grande, certifique-se de fazer um bom backup antes de implementar as alterações.
Mesmo quando você muda para innodb_file_per_table, as tabelas InnoDB que estão dentro do ibdata1 devem ser extraídas do ibdata1. Infelizmente, você não pode recuperar esse espaço de volta.
Você deve revisar a infraestrutura do InnoDB para que innodb_file_per_table funcione para você. @BMDan já mencionou isso em seu comentário.