O Virtual Box de 64 bits do Kali Linux é na verdade um arquivo de Caixa Virtual pré-configurado. Kali Linux 2016.1 64 bits ISO é a imagem de instalação para Kali.
Para ser claro, a versão do Virtual Box é basicamente um arquivo que você abre com o Virtual Box, a versão ISO é um arquivo que você grava em um DVD ou dd
em um pendrive para que você possa instalar o seu sistema operacional em uma máquina.
Portanto, a resposta é NÃO: você não precisa usar o ISO para criar uma máquina virtual Kali se já tiver um pacote de caixa virtual.