Não.
Normalmente, tudo que um reprodutor de mídia faz é apenas reproduzir o arquivo, ou seja, obter o identificador de arquivo do sistema e ler dos dados do arquivo. Na maioria dos casos, os dados são pré-armazenados em cache do disco na memória principal, portanto, a reprodução não é afetada pelo acesso ao disco de outros programas, e seu disco rígido nem sempre é lido.
De qualquer forma, um media player normalmente não escreve no arquivo, o que significa que seu arquivo não será tocado. Mesmo se o processo for encerrado inesperadamente (por exemplo, forçando-o a sair), o sistema operacional liberará apenas o identificador de arquivo.
Você pode até testar isso. Veja se alguma das informações do arquivo é alterada (por exemplo, registros de data e hora, horário "modificado") quando você o reproduz. Nenhum jogador decente deve fazer isso sem que você altere ativamente as informações e pressione um botão "salvar". Existem alguns jogadores que se comportam de maneira diferente. *
* Por exemplo, o iTunes atualizará automaticamente as informações do ID3 em arquivos MP3 assim que você alterar algo na caixa de diálogo "Informações". Isto é, na minha opinião, não como deve funcionar, mas estas gravações só acontecem uma vez, o que significa que você provavelmente não irá apenas "perder" um arquivo se algo der errado.