Nunca encontrei um problema que defrauda uma unidade host de uma máquina virtual, pois as máquinas virtuais são simplesmente uma coleção de arquivos no sistema de arquivos do Windows, que compõem coisas como seus drivers virtuais, memória que foi armazenada para VMs suspensas e seus instantâneos.
A defraudação resultará em um ganho de desempenho, especialmente ao carregar uma VM suspensa, ou ler dados de seus discos virtuais, já que o disco rígido real não terá que procurar tanto para localizar os fragmentos. É difícil dizer quanto de ganho de desempenho você receberia, pois depende muito da velocidade de leitura das unidades e do tamanho dos arquivos da VM que estão sendo lidos, etc.
Se você está realmente preocupado, você sempre pode ser cauteloso e clonar cada máquina em uma unidade separada, no caso improvável de o processo de desfragmentação corromper algo.