Se você quiser fazer um LiveUSB para instalar a partir de então não, os arquivos existentes não serão excluídos pelo programa "criador de disco de inicialização". O pendrive USB já precisará ser formatado como FAT, entretanto, a tabela de partição precisará ser aceita pelo programa, e será necessário espaço suficiente para o arquivo iso e persistência se você quiser um.
Outros criadores de dispositivos de inicialização USB podem funcionar de forma diferente.